• Preparar reagentes: diluir 1 volume de tampo de lavagem concentrado (20×) com 19 volumes de água destilada, misturar bem.
• Adicionar amostras: abra a bolsa de folha e remova a Microplate. Configure 1 poço em branco, 2 poços como controle negativo, 2 poços como controle positivo.distribuir 50μL de amostra ou controlo negativo ou controlo positivo para os respetivos poçosVibra suavemente a placa.
• Incubaço: cobrir a microplaca com uma tampa de placa e incubaço da microplaca revestida num banho de água controlado pelo termostato ou numa incubadora de microplacas a 37 °C durante 60 minutos.
• Lavar a placa: remover a tampa da placa. aspirar o conteúdo de todos os poços. encher os poços com o tampo de lavagem diluído (de 10 a 20 segundos para mergulhar) e aspirar novamente.Repita o procedimento 5 vezesCertifique-se de que o volume de repouso é mínimo, batendo na placa em papel absorvente.
• Adicionar conjugado: adicionar 100 μL de conjugado a cada poço (exceto o poço em branco).
• Incubaço: Cubra a Microplaca e incuba a placa a 37°C durante 30 minutos.
• Lavar a placa: repetir o procedimento de lavagem como no passo 4.
• Adicionar substrato: adicionar 50 μl de soluço de substrato A e 50 μl de soluço de substrato B a cada poço, misturar bem, cobrir e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
• Reacço de interrupço: adicionar 50μL de soluço de interrupço a cada poço, misturar bem.
• Leia-se a absorvência a 450 nm. Se for utilizada uma mediço com dois comprimentos de onda, o comprimento de onda de referência deve ser escolhido entre 620 nm e 690 nm.

PRECAUÇÕES

• Deixar que todos os componentes do kit atinjam a temperatura ambiente antes de serem utilizados.
• Seguir rigorosamente a instruço para controlar a temperatura e o tempo de reaço.
• No misture componentes de números de lote diferentes para utilizaço.
• O kit deve ser conservado a 2- 8°C. No utilize os componentes do kit após a data de validade.